半干转转印对滤纸要求较高，要用超厚滤纸，如伯乐厚度2.4mm滤纸（伯乐货号：1703965）。或者选择半干转转印滤布（货号：SP1010）

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5×RealBlot快速半干转转膜缓冲液（粉末型）

             5×RealBlot Fast Semi-Dry Transfer buffer（power）       

Ver750278-1.0

● 产品组成：

货号	名称	规格
RT5030P	5×RealBlot快速半干转转膜缓冲液（粉末型）	500 ml
	说明书	一份

● 产品简介：

5×RealBlot快速半干转转膜缓冲液使用独特配方，使用半干转法（Semi-dry blot）方法，能在10-20分钟内高效快速地将蛋白转移到印迹膜（PVDF膜或NC膜）上。

特点：

环境友好：快速转膜液可以不使用甲醇，减轻了对实验者和环境的伤害。

兼容性好：快速转膜液能兼容Tris-甘氨酸胶，Bis-Tris胶等多种凝胶。

节省时间：快速转膜液能在10-20分钟内完成蛋白的转印。

本产品为粉末型包装，溶于水后可以配制500 ml 5×RealBlot快速半干转转膜缓冲液。以每次转印使用100 ml 1×RealBlot快速半干转转膜缓冲液计算，该产品可以使用25次。

● 贮存、效期及运输：

   常温贮存；有效期3年；常温运输。

● 使用说明：

转膜前的准备：

半干转转印滤布（货号：SP1010）或2张半干转专用超厚滤纸（厚度2.4 mm）；裁好的转印膜；足够的1×RealBlot快速半干转转膜缓冲液；无水甲醇；无水乙醇。

1. 按照下表配制5×RealBlot快速半干转转膜缓冲液（溶液型）：

加入顺序	组份	5×RealBlot快速半干转转膜缓冲液（溶液型） 500 ml
1	5×RealBlot快速半干转转膜缓冲液（粉末型）	全部粉末
2	超纯水	定容至500 ml
		磁力搅拌至完全溶解

2. 按照下表配制1×RealBlot快速半干转转膜缓冲液：

加入顺序	组份	1×快速转膜液配制量 500 ml	备注
1	5×快速转膜液（溶液型）	100 ml
2	超纯水	约200 ml
3	无水乙醇或者无水甲醇	100 ml	两者选择其一。用乙醇更环保，用甲醇转膜效果更好。
4	超纯水	定容至500 ml

注：2.1 按照顺序加入各种溶液。如果加入转膜液后不加水而是加入醇将会产生沉淀。

    2.2 配好的转膜缓冲液4度预冷30-60分钟再使用，将会大大降低转膜时的发热量。

3. 将滤布或滤纸浸泡在1×快速转膜液中，完全浸湿3-5分钟。

4. PVDF膜使用前要用无水甲醇润湿30秒，浸泡在1×快速转膜液中，平衡5分钟。NC膜无需处理，直接浸泡在转膜缓冲液中。

5. 将凝胶在超纯水中浸泡漂洗2分钟，去除胶表面的SDS。

6. 按照顺序做好转印三明治结构：

                                                                     图二

 

 

6.1 排列顺序（图一）：1 负极（阴极）-2一张超厚滤纸或四层滤布-3 凝胶-4 转印膜-5一张超厚滤纸或四层滤布-6 正极（阳极）

6.2凝胶在转印槽中的排列（图二）：

一板胶尽量排布在转印槽中间位置；两板胶把小片段靠近（foot-to-foot）排布在转印槽中间位置。

7. 用滚轮赶出气泡。

8. 半干转推荐使用恒流转移：

分子量范围和凝胶厚度			一块小型胶 （7.3×8.5 cm）	两块小型胶（7.3×8.5 cm） 或一块中型胶（8.5×13.5 cm）
1.5 mm凝胶			下列条件基础上增加5-10分钟	下列条件基础上增加5-10分钟
1 mm凝胶	高分子量	大于130 kD	恒流1.3 A，20分钟	恒流2.5 A，20分钟
	混合分子量	5-130 kD	恒流1.3 A，15分钟	恒流2.5 A，15分钟
	低分子量	小于30 kD	恒流1.3 A，10分钟	恒流2.5 A，10分钟

注：不同厂家半干转仪器设置可能有所不同，请根据厂家说明书适当调整。

 

●  实验示例：

电泳：4-18%预制胶
电泳：1×TGS 200V 57-23mA 50min
滤纸：2.4mm厚滤纸（Bio-Rad 1703965）
转印膜：0.22 NC膜（Cat：ML-NC-152022-5）
仪器：Turbo半干转机器 恒流1.3A 10min
染色：膜丽春红染色

● 常见问题：

Q1.为什么转膜后胶上还是有可见的预染Marker或考马斯亮蓝染后胶上有比较多的残余蛋白？

A1：目前没有任何一种转膜方法可以做到100%完全把蛋白从凝胶转移到膜上，转移结束后凝胶上总是或多或少地残留着蛋白。一般说来，快速半干转可以比较完全地把预染Marker转移到膜上，然而对目的蛋白转移来说，或多或少在胶上会有残余。相对于低分子量蛋白来说，高分子量蛋白在胶上的残余会更加明显。如果半干转转膜后发现预染Marker在胶上都明显可见，说明您需要优化转膜条件。可以延长转膜时间或/和使用甲醇配制转膜缓冲液。我们的实验结果发现，使用甲醇配制转膜缓冲液至少可以提高20%的转膜效率（图三）。

图三

Q2. 配制1×转膜缓冲液时，可以使用甲醇代替乙醇吗？

A2：可以使用甲醇代替乙醇，并且使用甲醇配制的转膜缓冲液转膜效率要高于乙醇（图三）。然而，考虑到甲醇的毒性和环境的不友好，请谨慎选择是否使用。

Q3. 转膜缓冲液含有SDS吗？

A3：转膜缓冲液中含有SDS，SDS带负电荷，可以有效提高转移效率。

Q4. 转膜结束后发现三明治温度很高，有烧胶变黄的现象，应当如何避免？

A4：使用推荐的转膜条件，基本可以避免烧胶现象。如果出现了烧胶现象，可以采用以下方案优化。第一 提前将浸泡有厚滤纸（厚2.4 mm）或滤布的转膜缓冲液4度预冷30-60分钟。第二 尽量不要使用多层叠加放置的薄滤纸（一般湿转用的滤纸厚度会低于1 mm），它们吸水和保水能力较弱，在高电流的转膜条件下缓冲液很容易挥发殆尽，导致烧胶现象。第三 如果无奈使用多层薄滤纸进行半干转实验，建议缩短转膜时间，然而会导致转膜效率降低，胶上残余较多。

Q5. 5×RealBlot快速半干转转膜缓冲液能用于伯乐Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer Cell吗？

A5：伯乐的SD系统是老式半干转系统，5×RealBlot快速半干转转膜缓冲液与其不兼容，不建议使用。

Q6. 5×RealBlot快速半干转转膜缓冲液适用于哪些半干转机器？

A6. 目前已经测试的机器列表如下：