蓝色预染超低分子量蛋白质Marker（3.3-31 kD）

 

Blue Ultra Low Molecular Weight Protein Marker (3.3-31 kD)              Ver750260-1.0

●产品编号及规格：

RTD6152   10次（100 μl）

● 贮存、运输及效期：

   -20℃贮存；湿冰运输；有效期12个月。

● 产品简介：

本产品包含预染的3种多肽和2种低分子量蛋白质组成，分子量大小范围为~3. 3，~6.5，~14.4，~20.1，~31 kD。可以用于直接观察蛋白质电泳状况以及清晰地判断Western Blot的转膜效果。经Tricine-甘油SDS-PAGE凝胶电泳时以及转移到PVDF或NC膜上可看到清晰的5条蓝色的蛋白条带。以每次上样10 μl计算，该产品可以使用20次。

● 使用说明：

第一次收到该产品，常温融化后，彻底混匀，离心快甩将溶液完全收集到管底。本产品为即用型，溶化后既能使用，不能95℃加热处理。

一. 制胶：

先配制分离胶，聚合后再配制夹层胶，最后配制浓缩胶，3种胶的制胶体积比约为4.5:1.5:1.5（注：表一中夹层胶和浓缩胶配制体积是过量的，制胶时不要全部加入）。

1.1 配制分离胶：

1.1.1 按照表一将不同体积的组份加入到小烧杯中混合。

1.1.2 加入10%APS和TEMED，立即混匀以使溶液混匀。

1.1.3 在玻璃板中灌入分离胶溶液，然后轻轻覆盖一层1-3 cm的无水乙醇，使凝胶表面保持平整。

1.1.4 静置10-20分钟，待分离胶和乙醇层之间出现一个清晰的界面表示凝胶已聚合。

注：凝胶的聚合时间与环境温度有关。夏天温度较高时，聚合较快；冬天气温低时，聚合时间会延长。分离胶37℃约10分钟，25℃约15分钟，18℃ 约20分钟可以聚合。

1.2 配制夹层胶：

1.2.1 去除覆盖在分离胶上的醇，用滤纸将残留的醇吸去。

1.2.2 按照表一将不同体积的组份加入到小烧杯中混合。

1.2.3 加入10%APS和TEMED，立即混匀使溶液混匀。

1.2.4 在玻璃板中灌入适量夹层胶溶液，然后在溶液上轻轻覆盖一层1-3cm的无水乙醇，使凝胶表面保持平整。注：此溶液为过量，请勿全部注入。

1.2.5 静置20-30分钟，待夹层胶和乙醇层之间出现一个清晰的界面表示凝胶已聚合。

注：凝胶的聚合时间与环境温度有关。夏天温度较高时，聚合较快；冬天气温低时，聚合时间会延长。夹层胶37℃ 20分钟，25℃ 25分钟，18℃ 约30分钟可以聚合。

1.3 配制浓缩胶

 

1.3.1 去除覆盖在夹层胶上的乙醇，用滤纸将残留的醇吸去。

1.3.2 按照表一将不同体积的组份加入到小烧杯中混合。

1.3.3 加入10%APS和TEMED，立即混匀，以使溶液充分混匀。

1.3.4 将梳子插入凝胶内，避免产生气泡。

1.3.5 静置20-40分钟装待凝胶聚合。

注：凝胶的聚合时间与环境温度有关。夏天温度较高时，聚合较快；冬天气温低时，聚合时间会延长。浓缩胶37℃ 20分钟，25℃ 30分钟，18℃ 40分钟可以聚合。

表一  （一块1 mm 厚度小板胶用量）

	分离胶	夹层胶	浓缩胶
	16.5%T6%C/4.5 ml	10%T3%C/2 ml	5%T3%C/2 ml
49.5%T 3%C	/	0.4 ml	0.2 ml
49.5%T 6%C	1.5 ml	/	/
4×凝胶缓冲液	1.125 ml	0.5 ml	0.5 ml
50%甘油（v/v）	0.9 ml	-	-
ddH2O	0.95 ml	1.1 ml	1.3 ml
10%APS	~45 μl	~20 μl	~20 μl
TEMED	~4.5 μl	~2 μl	~2 μl

注：如非必须，不要使用1.5mm厚度的凝胶，这样会减少电泳后染色和脱色的时间。

二. 电泳：

2.1 电泳缓冲液配制：

  电泳前，将10×阳极缓冲液（Cat No:AB080）和10×阴极缓冲液（Cat No:CB010）用蒸馏水稀释成1×缓冲液备用。

2.2 样品处理：

  待上样的检测样品与2×Tricine上样缓冲液(Cat:TP050)等体积混合，95℃处理5分钟后上样。蛋白Marker一般已经含有上样缓冲液，预染Marker不能加热处理，混匀后直接上样，非预染Marker一般需要95℃处理5 min后上样。

2.3 电泳：

  将电泳槽的外槽加入1×阳极缓冲液，内槽加入1×阴极缓冲液，轻柔拔出梳子，将Marker或蛋白样品加入点样孔，稳压电泳（电泳条件参考下表）

浓缩胶	恒压 30 V	35-45 min
夹层胶	恒压 80 V	30-40 min
分离胶	恒压 120 V	80-100 min
待指示前沿到达分离胶下沿时,即可停止电泳，电泳时间总计2-4小时

 三. 凝胶检测：

 

注：多肽染色可以用配方7和8（表二）进行染色和观察。如果使用该配方进行染色时效果不好或考虑其毒性，请选择FastBlue蛋白染色液（Cat No：RTD6202），该产品能在60分钟之内完成蛋白的染色，不至于小肽在染色和脱色中从凝胶中脱离，是常规染色液的理想替代品。

3.1 染色（以FastBlue蛋白染色液染色为例）：

3.1.1 将电泳后的PAGE胶取下放入塑料容器中,用适量蒸馏水漂洗，去除胶表面的SDS，残余SDS会导致染色液出现沉淀。

3.1.2 弃蒸馏水，加入适量染色液（以刚刚覆盖过胶面为适),摇床上常温摇动，根据下表确定染色时间。

待检测蛋白量	染色时间
＞1 μg	~5分钟
100 ng-1 μg	~10分钟
10 ng-100 ng	~60分钟

3.2 转膜：

多肽电泳后转膜选择孔径0.22 μm PVDF膜（用前用甲醇处理润湿）或0.22 μm NC膜。

3.2.1 半干转：

使用伯乐Trans-Blot Turbo半干转机器请选择配套的5×RealBlot快速半干转转膜缓冲液（货号：RT5030），推荐转膜条件:一板小型凝胶(8×10 cm)恒流,1.3 A,10-15 min。

3.2.1 湿转：

湿转转膜缓冲液(25 mM Tris,192 mM Glycine, 0.01%SDS，20% Methanol,pH~8.3），可以选择10×Tris-甘氨酸转膜缓冲液（货号：TB1040）。推荐转膜条件：恒流200 mA  40-60 min。

四.小分子蛋白质SDS-PAGE电泳试剂配制：

1. 49.5%T3%C PAA(Cat:PS080)        丙稀酰胺         48 g        甲叉双丙稀酰胺  1.5 g  用ddH2O溶解后定容至100 ml， 过滤后使用。 贮存：4℃	2. 49.5%T6%C PAA（Cat:PI080）        丙稀酰胺         46.5 g        甲叉双丙稀酰胺      3 g  用ddH2O溶解后定容至100 ml， 过滤后使用。 贮存：4℃	3. 4×凝胶缓冲液(Cat:GB010） [4 M Tris; 0.4% SDS; pH8.45] Tris碱  48.4 g ddH2O   80 ml 0.4 g SDS或4 ml 10％ SDS 用HCl调pH值至8.45 25℃. 用ddH2O定容至100 ml；贮存：4℃
4. 10×阳极缓冲液（Cat:AB080） [2 M Tris pH8.9] Tris碱    121.1 g ddH2O      400 ml 用HCl调pH值至8.9 用ddH2O定容至500 ml 贮存：4℃ 注：使用前稀释成1×阳极缓冲液使用。	5. 10×阴极缓冲液（Cat:CB010） [1M Tris;1M Tricine;1% SDS;pH 8.3] Tris碱  121.14 g Tricine  179.2 g SDS 10 g 用水溶解，定容至1000 ml(不用调pH)。 贮存：4℃ 注：使用前稀释成1×阴极缓冲液使用	6. 2×Tricine多肽上样缓冲液(变性,还原) (Cat:TP050) 2 ml  1M Tris-Cl pH6.8 5 g 甘油 0.2 g  SDS 0.2 g DTT（或者400 μl β-巯基乙醇） 4 mg 考马斯亮蓝G-250 用灭菌ddH2O定容至10 ml 混匀分装-20℃贮存备用
7. 染色液 冰醋酸            100 ml 考马斯亮蓝G-250   0.25 g 水                900 ml	8. 脱色液 冰醋酸  100 ml 水      900 ml	9. 50%甘油 甘油               50 ml（63克） 超纯水            定容到100 ml 贮存：4℃