Blue/Clear 非变性凝胶电泳试剂盒（手灌胶）

   Blue/Clear Native PAGE Electrophoresis Kit  Ver.731072

货号	名称	包装
RTD6140	Blue/Clear 非变性凝胶电泳试剂盒(手灌胶)	10 次

● 货品内容：

组份	货号	名称	规格	保存
1	RTD6140-01	2×BN/CN凝胶缓冲液	40 ml	4℃
2	AC2914-30ml	40% PAA（29:1）	30 ml	4℃
2	BC500P	10×BN/CN PAGE电泳缓冲液(干粉)	500 ml	RT
3	PL114-01	4×BN/CN-PAGE蛋白上样缓冲液	1 ml	-20℃
4	BC270	2% G-250染料（电泳用）	20 ml	RT
5	BC260-01	5% G-250染料（上样用）	1 ml	4℃
6	SR0510	浓缩胶红色添加染料(200×)	0.5 ml	RT
7	AP020P	APS（干粉）	0.5 g	RT(配制后-20℃贮存)
8	TA0761	TEMED	0.5 ml	4℃ 避光
9		说明书	一份

● 产品简介：

Blue/Clear Native PAGE（BN/CN-PAGE）是一种从生物样品（质膜，胞浆等）中分离分子量10 kD-10 M kD 范围的蛋白质复合物的电泳技术。其原理是用温和去污剂(如 DDM，digitonin)将蛋白复合体从细胞膜中以近似天然的状态分离出来，Blue Native PAGE （BN-PAGE）是用考马斯亮蓝 G-250 代替 SDS与蛋白结合而使其带负电荷，根据蛋白分子量不同在 PAGE胶中得到分离；Clear Native PAGE（CN-PAGE）是电泳缓冲液中不加入任何染料，电泳中始终保持蛋白的天然电荷和活性状态，然而，其蛋白的分辨率要低于Blue Native PAGE。另外，BN-PAGE由于考马斯亮蓝G-250存在，使蛋白都覆盖上负电荷，可以分离碱性蛋白（pI＞7）和酸性蛋白(pI＜7)；而CN-PAGE只适合于酸性蛋白（pI＜7）的分离。

本产品包括BN/CN-PAGE制胶的所有成分，方便使用。可以用于分离分子量在 10 kD-500 kD 的蛋白复合体，样品可以来于胞浆、细胞总裂解液、细胞膜、线粒体膜和叶绿体膜等。电泳后可直接用于考染、银染、Western 杂交、SDS-PAGE电泳、蛋白纯化、蛋白活性检测等分析实验，也可直接用于电洗脱制备蛋白。

试剂盒配套有红色浓缩胶添加染料,凝固后的浓缩胶为红色,有利于在蓝色电泳缓冲液中观察加样孔,方便上样。

本试剂盒大约可以配制8-25块常规大小（8×10 cm）PAGE凝胶，具体数量根据凝胶浓度和厚度决定，1 mm厚度8%凝胶可以配制至少10块胶。

● 运输和贮存：

本产品常温运输；组份按照标签温度贮存；有效期一年。

● 使用说明：

一. 样品制备：

   该试剂盒不含样品制备的相关试剂，根据样品种类，具体选择不同提取方法。植物类囊体BN样品制备可以选择植物类囊体膜提取试剂盒（货号：RTU5002）；动物总蛋白BN样品制备可以选择动物胞浆活性蛋白提取试剂盒（不含去垢剂，离心柱法）（货号：RTD8106）；动物膜蛋白BN样品制备可以选择动物膜蛋白提取试剂盒(细胞)（货号：RTD8111）和动物膜蛋白提取试剂盒(组织)（货号：RTD8112）；动物线粒体BN样品制备可以选择动物细胞线粒体提取试剂盒（货号：RTD8115）和动物组织线粒体提取试剂盒（货号：RTD8117）。

二. 制胶：

2.1 分离胶制备：

2.1.1 不同浓度的分离胶的最佳分离范围：

分离胶浓度	最佳分离范围
6%	80-500 kD
8%	50-350 kD
10%	20-150 kD
12%	15-100 kD
15%	10-80 kD

 

2.1.2根据表一，将不同体积的成分在小烧杯中混合，轻轻搅拌使其混匀，避免产生气泡

2.1.3在凝胶模具中灌入适量分离胶溶液（对于mini-gel，凝胶液加至约距前玻璃板顶端1.5 cm或距梳齿约0.5 cm即可），然后在分离胶溶液上轻轻覆盖一层1-3 cm的水层，使凝胶表面保持平整。

2.1.4静置15-30分钟，待分离胶和水层之间出现一个清晰的界面后，说明凝胶已聚合。

注：凝胶的聚合时间与环境温度有关。夏天温度较高时，聚合较快；冬天气温低时，聚合时间会延长。可以根据环境温度的不同调节APS的加入量。

表一 Blue/Clear Native PAGE分离胶配方表

（以一块1.0 mm厚度mini胶为例）

	分离胶总体积 5 ml
	6%	8%	10%	12%	15%
组份	组份加入体积（ml）
灭菌水	1.7	1.45	1.2	0.95	0.57
2×BN/CN凝胶缓冲液	2.5	2.5	2.5	2.5	2.5
40％ PAA（29:1）	0.75	1	1.25	1.5	1.875
10％ APS	0.05	0.05	0.05	0.05	0.05
TEMED	0.005	0.005	0.005	0.005	0.005

2.2 浓缩胶制备：

2.2.1去除覆盖在分离胶上的水层。

2.2.2按照表二将不同成分在一个小烧杯中混合，轻轻搅拌使其混匀，避免产生气泡。

2.2.3将浓缩胶溶液加至分离胶的上面，直至凝胶溶液到达前玻璃板的顶端。

2.2.4将梳子插入凝胶内，避免产生气泡。

2.2.5静置30-60分钟，等待浓缩胶聚合。

注：凝胶的聚合时间与环境温度有关。夏天温度较高时，聚合较快；冬天气温低时，聚合时间会延长。可以根据环境温度的不同调节APS的加入量。

表二 Blue/Clear Native PAGE浓缩胶（4%）配方表（以一块1.0mm厚度mini胶为例）

组份	不同凝胶体积对应各组份的取样量
	浓缩胶总体积2 ml
H2O	0.8 ml
2×BN/CN凝胶缓冲液	1 ml
40％ PAA（29:1）	0.2 ml
浓缩胶红色添加染料(200×)	10 μl
10％ APS	20 μl
TEMED	2 μl

三. 电泳：

3.1 准备电泳缓冲液：

将10×BN/CN PAGE电泳缓冲液（干粉）溶于500 ml灭菌水中，彻底溶解，测定pH应为7.0左右，不要调节pH。用前稀释10倍即配成1×BN/CN PAGE电泳缓冲液。

3.1.1 CN-PAGE电泳：

阳极缓冲液和阴极缓冲液均直接使用1×BN/CN PAGE电泳缓冲液进行电泳。

3.1.2 BN-PAGE电泳：

阳极缓冲液(外槽)使用1×BN/CN PAGE电泳缓冲液，阴极缓冲液(内槽)按照下表配制：

	1×蓝色阴极缓冲液
	150 ml
10×BN/CN PAGE电泳缓冲液	15 ml
2% G-250 染料（电泳用）	1.5   ml
超纯水	定容至150 ml

3.2 准备样品：

3.2.1 CN-PAGE电泳：

总体积	10 μl
蛋白样品	x μl
4×BN/CN-PAGE蛋白上样缓冲液	2.5 μl
超纯水	补至10 μl
	不要加热

 

3.2.2 BN-PAGE电泳：

3.2.2.1 植物类囊体膜蛋白电泳：

总体积	10 μl
	含去垢剂样品*
植物类囊体膜蛋白样品 （2%DDM增溶）	x μl
4×BN/CN-PAGE蛋白上样缓冲液	2.5 μl
5% G-250染料（蛋白上样）	1 μl
超纯水	补至10 μl
	不要加热

*植物类囊体膜蛋白电泳中，含去垢剂样品中染料加入按照以下原则：

植物类囊体样品中G250终浓度为去垢剂终浓度的1/4。例如样品中DDM（n-Dodecyl β-D-maltoside，β-DM， n-十二烷基-β-D-麦芽糖苷）终浓度为2%，则需要G-250终浓度为0.5%。10 μl蛋白样品中需要加5% G-250染料1 μl。

3.2.2.2 动物线粒体BN样品电泳：

总体积	10 μl
	含去垢剂样品*
动物线粒体BN样品 （1%DDM增溶）	x μl
4×BN/CN-PAGE蛋白上样缓冲液	2.5 μl
5% G-250染料（蛋白上样）	0.25 μl
超纯水	补至10 μl
	不要加热

*动物线粒体BN样品电泳中，含去垢剂样品中染料加入按照以下原则：

动物线粒体BN样品中G250终浓度为去垢剂终浓度的1/8。例如样品中DDM终浓度为1%，则需要G-250终浓度为0.125%。10 μl蛋白样品中需要加5% G-250染料0.25 μl。

3.2.2.3 不含去垢剂样品：

总体积	10 μl
不含去垢剂样品	x μl
4×BN/CN-PAGE蛋白上样缓冲液	2.5 μl
5% G-250染料（蛋白上样）	- #
超纯水	补至10 μl
	不要加热

# 不含去垢剂样品可以不必添加5%G-250染料。

 

 

3.3电泳过程；

 

3.3.1 CN-PAGE电泳：

电泳内外槽均使用1×BN/CN PAGE电泳缓冲液。在电泳槽的内槽内加入1×BN/CN PAGE电泳缓冲液(让电泳缓冲液漫过加样孔)，轻轻拨出预制胶梳子，用1ml吸头冲洗加样孔3次，随后在电泳槽外槽加入适量的1×BN/CN PAGE电泳缓冲液。

CN-PAGE电泳
恒电压	起始电流	结束电流	电泳时间
120V	10-15mA/板胶	4-10mA/板胶	50+min
注：冰浴电泳

3.3.2 BN-PAGE电泳：

BN-PAGE电泳外槽使用1×BN/CN电泳缓冲液；内槽开始电泳使用的是1×蓝色阴极缓冲液，冰浴电泳，等待电泳指示前沿到达距离凝胶顶部2/3处时，将电泳缓冲液更换为1×BN/CN电泳缓冲液，继续后续电泳，因为过多染料会影响蛋白在凝胶中的迁移以及蛋白后续的转膜实验。

 

BN-PAGE电泳条件（一板胶）

恒电压	起始电流	电泳时间	缓冲液
120 V	8-15 mA	20-25 min	1×蓝色阴极缓冲液	冰浴电泳

指示前沿至凝胶顶部三分之二处，更换内槽缓冲液为无色1×BN/CN 电泳缓冲液

恒电压	继续电泳时间	结束电流	缓冲液
120 V	45 min +	3-5 mA	1×BN/CN电泳缓冲液	冰浴电泳

四. 转膜：

BN-PAGE转膜必须用PVDF膜，不能用NC膜，因为NC膜与G-250结合非常紧密。

转膜缓冲液可以使用10×BN转膜缓冲液（货号：BC600P）。

五. 染色：

5.1 将电泳后的PAGE胶取下放入塑料容器中，加入适量FastBlue蛋白染色液（以刚刚覆盖过胶面为适），条带1-2分钟即可见。

5.2 摇床常温摇动10-15分钟至条带清晰可见。

5.3 加入适量蒸馏水脱色，期间更换1-2次蒸馏水，摇床常温摇动10-15分钟至背景干净。

5.4 观察保存结果。

六. 实验示例：

                  RTD6140 Blue/Clear 非变性凝胶电泳试剂盒（手灌胶） WB检测
样品处理：K562悬浮细胞提取胞浆活性蛋白（货号：RTD6106 动物活性蛋白提取试剂盒（不含去垢剂）） 
4×BN/CN-PAGE蛋白上样缓冲液（货号：PL114） 调整蛋白浓度为1μg/μl上样液，梯度上样5-20μg
电泳：8% BN手灌胶，稳压200V 1×蓝色阴极缓冲液至指示前沿距离胶上沿2/3处，
更换为无色1×BN/CN PAGE电泳缓冲液，电泳时间共83分钟
转膜：0.45 μm PVDF膜，10×BN转膜缓冲液（货号：BC600P）稀释为1×BN转膜缓冲液加20%甲醇，
恒流200mA  2小时，未冰浴。
转膜效果检测：膜用丽春红染色液染色（货号：RTD6301）有可见条带，胶用FastBlue蛋白染色液染色
（货号：RTD6202）几乎无条带，证明转膜成功。膜用无水甲醇清洗5分钟去除膜上蓝色残余。
封闭：Western快速封闭液（货号：WR5020）  RT  封闭10 分钟；
一抗：兔单抗GAPDH 1:10000  RT 60min；二抗：羊抗兔IgG-HRP 1:5000 RT 60min，
ECL检测：RealECL发光液（货号：EC2520），曝光1秒。