超低分子量蛋白Marker V（3.5-42 kD）（非预染）

 

Ultra Low Molecular Weight Protein Marker V（3.5-42 kD）

Ver. 750271-2.0

 

RTD6113    20次（100 μl）

● 贮存、运输及效期：

  -20℃保存；湿冰运输；有效期1年。

● 贮存缓冲液成分：

65 mM Tris-HCl (pH 7.0), 20% Glycerol, 还原剂, 2% SDS, 0.005% 溴酚蓝。

● 产品简介：

   本产品包含8种低分子量蛋白质，分子量范围为3.5-42 kD，通过 Tris-Tricine-SDS-PAGE电泳并经考马斯亮蓝染色后可见分子量大小为3.5，4.5，8.5，14.4，17，21，30，42 kD的条带。

以每次上样5 μl计算，该产品可以使用20次。

技术规格
条带数量	8条
浓度	0.1-0.3 μg/μl
上样前处理	95-100℃加热处理5 min
推荐凝胶体系	16.5%或18%Tris-Tricine-SDS-PAGE
推荐上样体积	3-5 μl（1mm厚度10齿梳子）
推荐染色方法	非预染Marker，电泳时不可见条带，电泳后需要考马斯亮蓝染色可以观察条带
不适用于非变性电泳	为变性Marker，不适用于非变性电泳

 

● 使用说明：

1. 第一次收到该产品，常温融化后，彻底混匀，离心快甩10 Sec将溶液完全收集到管底，-20℃贮存；

2. 使用该产品时，常温解冻后轻轻混匀或用移液枪缓慢吹打均匀；

3. 从原液中吸取所需的上样量至新的微量离心管中；

4. 95-100°C下加热 5 min，使蛋白质完全变性；

5. 低速离心快甩10 Sec后，取 3-5 μl上样电泳；

一. 制胶：

多肽电泳建议使用Tris-Tricine-SDS-PAGE系统来分离蛋白，该系统可以分离1-100 kD的蛋白质（最优分离2.5-30 kD）。客户可以使用Tris-Tricine-SDS-PAGE凝胶快速制备及电泳试剂盒

（含预染Marker）（货号：RTD6121）或Tris-Tricine-PAGE凝胶制备及电泳试剂盒（多肽变性电泳）（货号：RTD6122）进行Tricine电泳，方便快捷。或者根据以下程序制备凝胶，先配制分离胶，聚合后再配制夹层胶，最后配制浓缩胶，3种胶的制胶体积比约为4.5:1.5:1.5。

1.1 配制分离胶：

1.1.1 按照表一将不同体积的分离胶组份加入到小烧杯中混合。

表一  （一块1 mm 厚度小板胶用量）

	分离胶	夹层胶	浓缩胶
	16.5%T6%C/4.5 ml	10%T3%C/2 ml	5%T3%C/2 ml
49.5%T 3%C	/	0.4 ml	0.2 ml
49.5%T 6%C	1.5 ml	/	/
4×凝胶缓冲液	1.125 ml	0.5 ml	0.5 ml
50%甘油（v/v）	0.9 ml	-	-
蒸馏水	0.95 ml	1.1 ml	1.3 ml
10%APS	~45 μl	~20 μl	~20 μl
TEMED	~4.5 μl	~2 μl	~2 μl

注：如非必须，不要使用1.5mm厚度的凝胶，这样会减少电泳后染色和脱色的时间。

1.1.2 加入10%APS和TEMED，立即混匀以使溶液混匀。

1.1.3 在玻璃板中灌入分离胶溶液，然后轻轻覆盖一层1-3 cm的无水乙醇，使凝胶表面保持平整。

1.1.4 静置10-20分钟，待分离胶和乙醇层之间出现一个清晰的界面表示凝胶已聚合。

注：凝胶的聚合时间与环境温度有关。夏天温度较高时，聚合较快；冬天气温低时，聚合时间会延长。分离胶37℃约10分钟，25℃约15分钟，18℃ 约20分钟可以聚合。

1.2 配制夹层胶：

1.2.1 去除覆盖在分离胶上的醇，用滤纸将残留的醇吸去。

1.2.2 按照表一将不同体积的夹层胶组份加入到小烧杯中混合。

1.2.3 加入10%APS和TEMED，立即混匀使溶液混匀。

1.2.4 在玻璃板中灌入适量夹层胶溶液，使液面和短玻璃板上沿之间的距离比梳齿长0.5 cm即可，然后在溶液上轻轻覆盖一层1-3cm的无水乙醇，使凝胶表面保持平整。注：此溶液为过量，请勿全部注入。

1.2.5 静置20-30分钟，待夹层胶和乙醇层之间出现一个清晰的界面表示凝胶已聚合。

注：凝胶的聚合时间与环境温度有关。夏天温度较高时，聚合较快；冬天气温低时，聚合时间会延长。夹层胶37℃ 20分钟，25℃ 25分钟，18℃ 约30分钟可以聚合。

1.3 配制浓缩胶

1.3.1 去除覆盖在夹层胶上的乙醇，用滤纸将残留的醇吸去。

1.3.2 按照表一将不同体积的浓缩胶组份加入到小烧杯中混合。

1.3.3 加入10%APS和TEMED，立即混匀，以使溶液充分混匀。

1.3.4 将梳子插入凝胶内，避免产生气泡。

1.3.5 静置20-40分钟装待凝胶聚合。注：凝胶的聚合时间与环境温度有关。夏天温度较高时，聚合较快；冬天气温低时，聚合时间会延长。浓缩胶37℃ 20分钟，25℃ 30分钟，18℃ 40分钟可以聚合。

二. 电泳：

2.1 电泳缓冲液配制：

  电泳前，将10×阳极缓冲液（Cat No:AB080）和10×阴极缓冲液（Cat No:CB010）用蒸馏水稀释成1×缓冲液备用。

2.2 样品处理：

  待上样的检测样品与2×Tricine上样缓冲液(Cat:TP050)等体积混合，95℃处理5分钟后上样。蛋白Marker一般已经含有上样缓冲液，预染Marker不能加热处理，混匀后直接上样，非预染Marker一般需要95℃处理5 min后上样。

2.3 电泳：

  将电泳槽的外槽加入1×阳极缓冲液，内槽加入1×阴极缓冲液，轻柔拔出梳子，将Marker或蛋白样品加入点样孔，稳压电泳（电泳条件参考下表）

	电压	电流变化	电泳时间
浓缩胶	恒压30 V	起始电流：~ 15 mA 终止电流：~ 10 mA	~40 min
		注：等待样品指示前沿到达夹层胶上沿时，调高电压
夹层胶	恒压80 V	起始电流：~ 35 mA 终止电流：~ 30 mA	~60 min
		注：等待样品指示前沿到达分离胶上沿时，调高电压
分离胶	恒压120 V	起始电流：~ 40 mA 终止电流：~ 20 mA	~100 min
待指示前沿到达分离胶下沿时,即可停止电泳，电泳时间总计约200 min。 注：恒压条件下，电流不可调节，电流是逐渐降低的，观察记录电流数值。

三. 凝胶检测：

3.1 凝胶染色（FastBlue蛋白染色液）：

3.1.1将电泳后的PAGE胶取下放入塑料容器中,用适量蒸馏水漂洗，去除胶表面的SDS，残余SDS会导致染色液出现沉淀。

3.1.2 弃水，加入适量染色液（以刚刚覆盖过胶面为适)，摇床上常温摇动，根据下表确定染色时间。

待检测蛋白量	染色时间
＞1 μg	~5分钟
100 ng-1 μg	~10分钟
10 ng-100 ng	~60分钟

3. 1.3 摇床上摇动至所有条带清晰可见。

3. 1.4 蒸馏水摇动漂洗脱色1-2次，每次5-10分钟，至凝胶背景干净。

3. 1.5 收集用过的染色液，可以重复使用2-3次。

凝胶也可以使用常规考马斯亮蓝染色液（配方7）和脱色液（配方8）进行染色和观察。需要注意的是，常规染色和脱色方法需要较长时间，小肽由于长度较短，和凝胶结合不紧密，长时间在溶液中浸泡容易从凝胶中脱离。FastBlue蛋白染色液（货号：RTD6202）除具有染色快，无毒，灵敏性高等特点外，还能对小肽在染色中起到固定作用，不至于小肽在染色和脱色中从凝胶中脱离，是常规染色液的理想替代品。

3.2 转膜：

多肽电泳后转膜选择孔径0.22 μm PVDF膜（用前用甲醇处理润湿）或0.22 μm NC膜。

3.2.1 半干转：使用伯乐Trans-Blot Turbo半干转机器请选择配套的5×RealBlot快速半干转转膜缓冲液（货号：RT5030），推荐转膜条件:一板小型凝胶(8×10 cm)恒流,1.3 A,10-15 min。

3.2.1 湿转：湿转转膜缓冲液(25 mM Tris,192 mM Glycine, 0.01%SDS，20% Methanol,pH~8.3），可以选择10×Tris-甘氨酸转膜缓冲液（货号：TB1040）。推荐转膜条件：恒流200 mA  40-60 min。

四.小分子蛋白质SDS-PAGE电泳试剂配制：

1. 49.5%T3%C PAA(Cat:PS080)        丙稀酰胺         48 g        甲叉双丙稀酰胺  1.5 g 用蒸馏水溶解后定容至100 ml， 过滤后使用。 贮存：4℃	2. 49.5%T6%C PAA（Cat:PI080）        丙稀酰胺         46.5 g        甲叉双丙稀酰胺      3 g  用蒸馏水溶解后定容至100 ml， 过滤后使用。 贮存：4℃	3. 4×凝胶缓冲液(Cat:GB010） [4 M Tris; 0.4% SDS; pH8.45] Tris碱  48.4 g 蒸馏水   80 ml 0.4 g SDS或4 ml 10％ SDS 用HCl调pH值至8.45 25℃. 用蒸馏水定容至100 ml，过滤后使用；贮存：4℃
4. 10×阳极缓冲液（Cat:AB080） [2 M Tris pH8.9] Tris碱    121.1 g 蒸馏水      400 ml 用HCl调pH值至8.9 用蒸馏水定容至500 ml 贮存：常温 注：使用前稀释成1×阳极缓冲液使用。	5. 10×阴极缓冲液（Cat:CB010） [1M Tris;1M Tricine;1% SDS;pH ~8.3] Tris碱  121.14 g Tricine  179.2 g SDS 10 g 用水溶解，定容至1000 ml(不要调pH)。 贮存：4℃或常温 注：使用前稀释成1×阴极缓冲液使用	6. 2×Tricine多肽上样缓冲液(变性,还原) (Cat:TP050) 2 ml  1M Tris-HCl pH6.8 5 g 甘油 0.2 g  SDS 0.2 g DTT（或者400 μl β-巯基乙醇） 4 mg 考马斯亮蓝G-250 用灭菌水定容至10 ml，混匀分装 贮存：-20℃
7. 染色液（Cat：RTD6203） 冰醋酸              10%（v/v） 甲醇                50%（v/v） 考马斯亮蓝G-250   0.2%（g/v） 贮存：常温	8. 脱色液（Cat：RTD6204） 冰醋酸  10%（v/v） 贮存：常温	9. 50%甘油 甘油               50 ml（63克） 超纯水            定容到100 ml 贮存：4℃