Tris-Tricine-SDS-PAGE凝胶快速制备及电泳试剂盒（含预染Marker）

Ver.750270-2.0

 

货号	名称	规格
RTD6121	Tris-Tricine-SDS-PAGE凝胶快速制备及电泳试剂盒（含预染Marker）	10次

 

● 产品组成：

序号	组分货号	名称	规格	贮存
1	RTD6121-01	2×浓缩胶聚合溶液	10 ml	4℃
2	RTD6121-02	2×分离胶聚合溶液	30 ml	4℃
3	RTD6121-03	2×凝胶缓冲液	40 ml	4℃
4	RTD6148	双色预染超低分子量蛋白质Marker (1.5-42 kD)	10次	-20℃
5	TP080-01	2×Tricine多肽上样缓冲液（变性，还原,含溴酚蓝）	1 ml	-20℃
6	AP020P	10% APS（干粉）	5 ml	RT，配制后-20℃
7	TA0761-01	TEMED	0.5 ml	4℃，避光保存
8	CB010P	10×Tris-Tricine-SDS缓冲液(变性电泳,粉末型)	500 ml	RT，配制后4℃
9	RTD6202-02	FastBlue蛋白染色液	500 ml	RT

● 产品简介：

该产品含有多肽电泳全套试剂，可以用来检测1-20 kD的多肽大小。本试剂盒可配制至少10块常规大小（8×10cm）,厚度1 mm的PAGE胶。该产品具有以下特点：

1. 分辨率高：凝胶缓冲液独特配方，可以有效分离1-5 kD多肽；

2. 使用方便：制胶无需计算所需溶液量；无需制备三层凝胶（浓缩胶，夹层胶，分离胶）；

3. 配套 Tris-Tricine-SDS缓冲液，无需区分阳极缓冲液和阴极缓冲液;

4. 试剂盒配套有预染蛋白Marker，方便检测多肽大小；

5. 试剂盒配套有快速蛋白染色液，最快可以在30分钟内完成染色过程，有效避免小肽从凝胶中游离。

● 贮存、运输及效期：

按照标签温度贮存；湿冰运输；有效期一年。

● 使用说明：

一. 制胶：

10%APS溶液配制：

10% APS为固体粉末，使用前加入5 ml双蒸水溶解即配制成10% APS溶液，将溶液分装后置于-20℃保存，通常一年内有效。该溶液在4℃条件下可以稳定保存两周。若发现凝胶聚合时间延长，应考虑更换使用-20℃保存的10% APS溶液。

1.1 配制分离胶:

1.1.1按照表一将不同体积的成分加入到小烧杯中混合；立即混匀5-10秒，以使溶液充分混匀。                   

表1 （一块厚度1 mm 8×10cm凝胶胶用量）*

	分离胶	浓缩胶
	18％T5C /5 ml	4％T 2.6C/1.5 ml
2×凝胶缓冲液	2.5 ml	0.75 ml
2×浓缩胶聚合溶液	/	0.75 ml
2×分离胶聚合溶液	2.5 ml	/
10%APS	~50 μl	~15 μl
TEMED	~5 μl	~1.5 μl

注： * 如非必须，不要使用厚度1.5 mm的凝胶，尽量使用厚度1 mm的凝胶，这样会减少电泳后染色和脱色的时间。

1.1.2 在玻璃板中迅速灌入适量分离胶溶液，使液面和短玻璃板上沿之间的距离比梳齿长0.5 cm即可。注：此溶液为过量，请勿全部注入。

1.1.3 然后在分离胶溶液上轻轻覆盖一层1-2 cm的无水乙醇层，使凝胶表面保持平整。

1.1.4 静置10-30分钟，待分离胶和乙醇层之间出现一个清晰的界面表示凝胶已聚合。

注：凝胶的聚合时间与环境温度有关。夏天温度较高时，聚合较快；冬天气温低时，聚合时间会延长。可以根据表1的标准条件调节促凝剂的加入量。分离胶在25℃条件下，约20分钟可以聚合。

1.2 配制浓缩胶:

去除覆盖在分离胶上的乙醇层，用滤纸将残留的乙醇吸去。

1.2.1 按照表一将不同成分加入到小烧杯中混合；立即混匀5-10秒，以使溶液充分混匀。

1.2.2 将梳子插入凝胶内，避免产生气泡。

1.2.3 静置30-50分钟待凝胶聚合。

注：凝胶的聚合时间与环境温度有关。夏天温度较高时，聚合较快；冬天气温低时，聚合时间会延长。可以根据表1的标准条件调节促凝剂的加入量。浓缩胶在25℃条件下，约40分钟可以聚合。

二. 电泳：

2.1 变性电泳缓冲液和样品配制：

2.1.1 10×Tris-Tricine- SDS缓冲液配制：

将10×Tris-Tricine-SDS缓冲液（10×TTS）粉末（Cat：CB010P）置于一干净的烧杯中，加入500 ml超纯水，彻底搅拌混匀，不要调节pH，即配成500 ml 10×缓冲液。超纯水稀释10倍配成1×Tris-Tricine-SDS缓冲液。

2.1.2 变性样品处理：

        待上样的检测样品与2×Tricine上样缓冲液（变性，还原，含溴酚蓝）[Cat No：TP080]等体积混合，95℃处理5分钟后上样。蛋白Marker一般已经含有上样缓冲液，根据说明书上样（预染Marker不能加热处理，非预染Marker上样前一般要95℃处理5分钟）。试剂盒配套的预染Marker（Cat：RTD6148）不要加热处理，溶化混匀后直接上样，1 mm厚度10齿梳子建议上样3-5 μl。

2.2 电泳：

将电泳槽的内槽加满电泳缓冲液，轻柔拔出梳子，用1 ml移液器将梳孔吹洗干净，将Marker或蛋白样品加入点样孔，稳压电泳（表2），至溴酚蓝指示前沿至分离胶下沿位置时即可停止电泳。整个电泳过程大约需要2.5-3个小时。

表2 多肽电泳条件（单板电泳）

	电压	电流变化	电泳时间
浓缩胶	恒压80 V	起始电流：30-35 mA 终止电流：25-30 mA	~20 min
		注：等待样品指示前沿到达分离胶上沿时，调高电压
分离胶	恒压120 V	起始电流：40-45 mA 终止电流：15-20 mA	~200 min
		注：恒压条件下，电流不可调节，电流是逐渐降低的，观察记录电流数值。

三. 染色：

3.1将电泳后的PAGE胶取下放入塑料容器中,用适量蒸馏水漂洗，去除胶表面的SDS，残余SDS会导致染色液出现沉淀。

3.2 弃蒸馏水，加入适量染色液（以刚刚覆盖过胶面为适)，摇床上常温摇动，根据下表确定染色时间。

待检测蛋白量	染色时间
＞1 μg	~5分钟
100 ng-1 μg	~10分钟
10 ng-100 ng	~60分钟

3. 3 摇床上摇动至所有条带清晰可见。

3. 4 蒸馏水摇动漂洗脱色1-2次，每次5-10分钟，至凝胶背景干净。

3. 5 收集用过的染色液，可以重复使用2-3次。

凝胶也可以使用常规考马斯亮蓝染色液和脱色液进行染色和观察。需要注意的是，常规染色和脱色方法需要较长时间，小肽由于长度较短，和凝胶结合不紧密，长时间在溶液中浸泡容易从凝胶中脱离。FastBlue蛋白染色液除具有染色快，无毒，灵敏性高等特点外，还能对小肽在染色中起到固定作用，不至于小肽在染色和脱色中从凝胶中脱离，是常规染色液的理想替代品。

四. 转膜：

多肽转膜选择孔径0.22 μm PVDF膜（用前用甲醇处理润湿）或0.22 μm NC膜。

4.1 半干转：

使用伯乐Trans-Blot Turbo半干转机器请选择配套的5×RealBlot快速半干转转膜缓冲液（货号：RT5030）。转膜推荐条件：一板小型凝胶（8×10 cm）恒流，1.3 A，7-10 min。

4.2 湿转：

湿转转膜缓冲液（25 mM Tris,192 mM Glycine, 0.01%SDS，20% Methanol,pH~8.3），可以选择10×Tris-甘氨酸转膜缓冲液（湿转，溶液型）（货号：TB1040）。转膜条件：恒流200 mA  40-60 min。

 

五. 实验示例：