RealPAGE plus彩色凝胶快速制备试剂盒

 RealPAGE plus Colour Gel Fast Preparation Kit

●  货品规格：

 

货号	说明	制胶数量
RTD6132-06	制备6%PAGE胶	125块 0.75mm胶 ＞90块1 mm胶 ＞60块1.5 mm胶
RTD6132-08	制备8%PAGE胶
RTD6132-10	制备10%PAGE胶
RTD6132-12	制备12%PAGE胶
RTD6132-15	制备15%PAGE胶

●  货品内容：

组份	货号	名称	规格	保存
1	RTD6132-UA	上层胶溶液A	80 ml	4℃
2	RTD6132-UB	彩色上层胶溶液B	80 ml	4℃
3	RTD6132-LA06	下层胶溶液A 6%	250 ml	4℃
	RTD6132-LA08	下层胶溶液A 8%	250 ml	4℃
	RTD6132-LA10	下层胶溶液A 10%	250 ml	4℃
	RTD6132-LA12	下层胶溶液A 12%	250 ml	4℃
	RTD6132-LA15	下层胶溶液A 15%	250 ml	4℃
4	RTD6132-LB	下层胶溶液B	250 ml	4℃
5	RTD6132-SP	改良型促凝剂	8 ml	4℃，配制后-20℃贮存
		说明书	一份

● 产品简介：

该产品利用聚丙烯酰胺凝胶电泳原理，采用合理设计的预混合配方和配制流程，可在50分钟内配制得到高质量的聚丙烯酰胺凝胶，用于变性和非变性蛋白凝胶电泳。本产品可以配制常用分离胶浓度6%、8%、10%、12%和15%，可以满足绝大多数蛋白电泳需求。

本试剂盒大约可以配制60-125块常规大小（8×10cm）PAGE凝胶，具体数量根据凝胶厚度决定：0.75mm厚度凝胶可以配制125块胶，1mm厚度凝胶可以配制至少90块胶，1.5mm厚度凝胶可以配制至少60块胶。

● 运输和贮存：

本产品常温运输；组份按照标签温度贮存；有效期一年。

● 特点：

1. 方便：彩色上层胶，方便上样；上层胶和下层胶溶液1:1混合，无需计算；

2. 安全：不用接触有毒粉末；不用单独添加TEMED；

3. 兼容性广：制胶溶液中不含SDS，可用于非变性电泳（Native-PAGE）；

● 使用说明：

一  凝胶制备：

1.1参照凝胶模具说明书，装配好凝胶模具。

1.2 根据下表参考选择合适的凝胶浓度

表一不同浓度的PAGE下层胶的最佳分离范围

下层胶（分离胶）浓度	最佳分离范围
6%	50-350 kD
8%	35-300 kD
10%	20-150 kD
12%	15-100 kD
15%	10-80 kD

 

 

 

1.3 根据下表配制凝胶：

表二 凝胶配制表

下层胶配方				上层胶配方
胶厚度	下层胶溶液B	下层胶溶液A	改良型促凝剂	胶厚度	彩色上层胶溶液B	上层胶溶液A	改良型促凝剂
0.75 mm	2 ml	2 ml	40 μl	0.75 mm	0.5 ml	0.5 ml	10 μl
1.0 mm	2.5 ml	2.5 ml	50 μl	1.0 mm	0.75 ml	0.75 ml	15 μl
1.5 mm	4 ml	4 ml	80 μl	1.5 mm	1 ml	1 ml	20 μl

1.3.1 取等体积下层胶溶液B 和下层胶溶液A ，各 2.0/2.5/4.0 ml，混匀；

1.3.2混合溶液中加入 40/50/80 μl的改良型促凝剂，轻轻混匀，将混匀后的溶液注入制胶玻璃板中，使液面和短玻璃板上沿之间的距离比梳齿长0.5 cm即可；

注意：此溶液为过量，请勿全部注入。

1.3.3 沿玻璃板缓慢加入适量灭菌水或无水乙醇覆盖于下层胶之上，待下层胶凝固后，倒去上层水或乙醇；

注意：当水（乙醇）和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝固；25℃时5-10分钟可以聚合。

1.3.4 取等体积彩色上层胶溶液B和上层胶溶液A ，各 0.5/0.75/1.0 ml，混匀；

1.3.5向混合溶液中加入 10/15/20 μl 的改良型促凝剂，轻轻混匀，插入梳齿；

1.3.6 待上层胶凝固后 （约20-40 min），拔去梳齿即可用于电泳。

注：凝胶的聚合时间与环境温度有关。夏天温度较高时，聚合较快；冬天气温低时，聚合时间会延长。

上层胶25℃ 20-25分钟可以聚合；18℃ 35-40分钟可以聚合。

 

二  电泳：

2.1 SDS-PAGE变性电泳：

2.1.1电泳缓冲液配制：

将5×Tris-甘氨酸-SDS电泳缓冲液干粉（自备，组份0.96 M 甘氨酸，0.125 M Tris，0.5% SDS）全部倒入1L烧杯中，加入约900 ml水彻底溶解，用水定容至1 L，即配成5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液（此溶液不用调节pH值）。用前再稀释5倍即配成1×Tris-甘氨酸-SDS电泳缓冲液。

2.1.2 样品处理：融化-混合-变性-上样

5×MonoColor蛋白上样缓冲液常温数分钟解冻后轻轻摇匀，以确保溶液混合均匀；将缓冲液与蛋白样品按照1：4的比例混匀，如8 μl样品加入2 μl 5×上样缓冲液；将蛋白样品置于95℃中加热5-10分钟；蛋白样品加入凝胶加样孔内电泳。

2.1.3 电泳过程；

在电泳槽的内槽内加入1×Tris-甘氨酸-SDS电泳缓冲液(让电泳缓冲液漫过加样孔)，轻轻的拨出梳子，用1ml吸头彻底冲洗加样孔，随后在电泳槽外槽加入适量的1×Tris-甘氨酸-SDS电泳缓冲液。

表三 SDS-PAGE电泳条件

恒电压	起始电流（一板胶）	结束电流（一板胶）	电泳时间	适用条件
150V	35-40 mA	15-20 mA	55 + min	最佳电压，最优的分辨率
200V	45-55 mA	20-25 mA	45+ min	节省时间
225V	40-50 mA	15-20 mA	35+ min
250V	65-75 mA	20-25 mA	30+ min
300V	70-80 mA	25-35mA	25+ min	最省时间

2.2 非变性电泳（Native PAGE）：

2.2.1电泳缓冲液配制：

将5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液干粉（自备，组份0.96 M 甘氨酸，0.125 M Tris）全部倒入1L烧杯中，加入约900 ml水彻底溶解，用水定容至1 L，即配成5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液（此溶液不用调节pH值）。用前再稀释5倍即配成1×Tris-甘氨酸-SDS电泳缓冲液。

2.2.2 样品处理：融化-混合-上样

5×非变性非还原蛋白上样缓冲液常温数分钟解冻后轻轻摇匀，以确保溶液混合均匀；将缓冲液与蛋白样品按照1：4的比例混匀，如8 μl样品加入2 μl 5×上样缓冲液；蛋白样品加入凝胶加样孔内电泳。注：非变性电泳样品不能加热处理。

2.2.3 电泳过程；

在电泳槽的内槽内加入1×Tris-甘氨酸电泳缓冲液(让电泳缓冲液漫过加样孔)，轻轻的拨出梳子，用1ml吸头彻底冲洗加样孔，随后在电泳槽外槽加入适量的1×Tris-甘氨酸电泳缓冲液。

 

表四 Native PAGE电泳条件

	恒电压	起始电流	结束电流	电泳时间	适用条件
推荐电压	150V	25-35/板胶	5-10 mA/板胶	60 + min	最佳电压，最优的分辨率

 

三. 染色：

1. 将电泳后的PAGE胶取下放入塑料容器中，加入适量FastBlue蛋白染色液或常规考马斯亮蓝染色液（以刚刚覆盖过胶面为适），条带1-2分钟即可见。

2. 摇床常温摇动10-15分钟至条带清晰可见。

3. 加入适量蒸馏水脱色，期间更换1-2次蒸馏水，摇床常温摇动10-15分钟至背景干净。

4. 观察保存结果。

 

四. 实验示例：