明胶酶谱分析试剂盒

      Gelatin Zymography Analysis Kit    Ver.710278

货号	名称	规格
RTD6143	明胶酶谱分析试剂盒	50次

 

● 产品组成：

货号	名称	规格	保存
RTD6143-01	4%浓缩胶聚合溶液A（2×）	40 ml	4℃
RTD6143-02	4%彩色浓缩胶溶液B（2×）	40 ml	4℃
RTD6143-03	10%分离胶聚合溶液A（2.5×）	100 ml	4℃
RTD6143-04	10%分离胶胶溶液B（2×）	125 ml	4℃
RTD6143-05	10×明胶底物	30 ml	RT (配制后-20℃)
RTD6143-06	10×复性缓冲液	250 ml	4℃
RTD6143-07	10×孵育缓冲液	500 ml	4℃
RTD6143-08	胶原酶阳性对照	0.5 ml	-20℃
RTD6202	FastBlue蛋白染色液	500 ml	RT
PL112	5×蛋白上样缓冲液 (变性，非还原)	1 ml	-20℃
TG120P	5×Tris-甘氨酸-SDS电泳缓冲液(干粉)	1 L	RT
AP020P	APS（干粉）	0.5 g	RT (配制后-20℃)
TA0761	TEMED	0.5 ml	4℃，避光
	说明书	一份

● 产品简介：

基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase, MMP）是一种锌依赖性酶，能切割细胞外基质成分，能在一定条件下水解明胶。细胞内的MMP以无活性的酶原形式分泌，活化后能够降解细胞外基质的胶原蛋白，通过影响细胞外基质，参与胚胎发育、形态发生、组织重塑等过程，并参与炎症、肿瘤、心血管、神经等许多疾病过程。血浆与组织中的MMP-2、MMP-9参与各种生理与病理过程，其在临床诊断和治疗中的意义日益受到重视。

本试剂盒采用酶谱法（Zymography）检测MMP-2、MMP-9 活性，其基本原理和程序是：制备含有胶原酶底物明胶的SDS-PAGE 凝胶，含蛋白酶的样品在此凝胶中进行电泳，电泳时，SDS与样本中的MMP可逆性结合，导致MMP氢键和疏水键被破坏而不能发挥分解明胶的作用。电泳结束后取出凝胶与孵育溶液孵育，MMP恢复活性，在其迁移位置水解凝胶中的明胶，考马斯亮蓝染色后凝胶中由于含底物蛋白而被深染，形成深色背景，但在有蛋白酶条带的位置，蛋白酶将降解凝胶中的底物蛋白，因而不被染色而形成透亮白色区域，从而能同时指示MMP-2、MMP-9 的大小位置（酶谱）及活性，其强弱与MMP活性呈正比。

本试剂盒提供明胶酶谱分析的全套试剂，试剂盒可进行50 次标准胶（8×10 cm）检测，如果小胶加样孔为10~15个，则总计可检测500~750 个样品。试剂盒配套有胶原酶阳性对照，可以有效分解明胶，方便判断凝胶及电泳体系是否有问题。

● 贮存及运输：

    按照试剂盒标签贮存；常温运输；开封后试剂盒有效期一年。

● 使用说明：

1. 10% APS配制-5 ml：

将0.5 gAPS干粉溶于5 ml灭菌水中，彻底溶解后分装，1 ml/支，-20℃备存，每次取一管使用。10% APS应尽量减少室温存放时间，以防失效。10%APS在4℃有效期为一周，-20℃有效期6个月。若发现凝胶聚合时间延长，应考虑更换使用-20度保存的10%APS。

2. 10×明胶底物配制：

明胶粉末加入30 ml灭菌水，60℃水浴中彻底融化，冷却至常温后使用。明胶底物配制后-20℃贮存。

一 分离胶制备：

1.1参照凝胶模具说明书，装配好凝胶模具。

1.2按照表格将不同体积的成分在小烧杯中混合；最后加入10%APS和TEMED，轻轻搅拌使其混匀，避免产生气泡。

		10%分离胶	4%浓缩胶
		5 ml	1.6 ml
加入顺序	组份	1.0 mm厚度凝胶
1	10%分离胶聚合溶液A（2.5×）	2.0 ml	-
2	10%分离胶胶溶液B（2×）	2.5 ml	-
3	10×明胶底物	0.5 ml	-
4	4%浓缩胶聚合溶液A（2×）	-	0.8 ml
5	4%彩色浓缩胶溶液B（2×）	-	0.8 ml
6	10％ APS	50 μl	16 μl
7	TEMED	5 μl	1.6 μl

1.3在凝胶模具中灌入适量分离胶溶液（对于mini-gel，凝胶液加至约距前玻璃板顶端1.5 cm或距梳齿约0.5 cm即可），然后在分离胶溶液上轻轻覆盖一层无水乙醇，使凝胶表面保持平整。

1.4静置5-10分钟，待分离胶和乙醇层之间出现一个清晰的界面后，说明凝胶已聚合

二 浓缩胶制备：

2.1去除覆盖在分离胶上的乙醇层。

2.2按照表格将不同体积成分在一个小烧杯中混合；最后加入10%过硫酸铵和TEMED，轻轻搅拌使其混匀，避免产生气泡。

2.3将浓缩胶溶液加至分离胶的上面，直至凝胶溶液到达前玻璃板的顶端。

2.4将梳子插入凝胶内，避免产生气泡。

2.5静置30-60分钟，等待浓缩胶聚合（25℃ 标准凝固时间为50分钟）。

注：凝胶的聚合时间与环境温度有关。夏天温度较高时，聚合较快；冬天气温低时，聚合时间会延长。可以根据表格标准条件调节催化剂的加入量。

三 电泳：

3.1 5×Tris-甘氨酸-SDS电泳缓冲液的配制：

   将一包干粉全部倒入1L烧杯中，加入约900 ml水彻底溶解，用水定容至1 L（此溶液不用调节pH值，pH 8.3-8.5）。电泳前将缓冲液稀释5倍即配成1×Tris-甘氨酸-SDS电泳缓冲液。

3.2 样品处理：融化-混合-上样

3.2.1 将5×蛋白上样缓冲液（变性，非还原）常温融化后混匀。

3.2.2 将上样缓冲液与蛋白样品按照1:4的比例混匀。

注：由于MMP活性需要二价阳离子，蛋白样品中避免使用EDTA、EGTA等二价阳离子鳌和剂以及巯基乙醇和DTT等。

蛋白样品提取可以选择RL0120F RIPA裂解液(强，不含抑制剂，不含螯合剂)

3.2.3 快甩离心收集到管底，常温放置5-10分钟，不要加热处理样品，上样电泳。

     胶原酶阳性对照同时上样5-10 μl。

3.3 电泳：

   在电泳槽的内槽加入1×电泳缓冲液，轻轻拨出梳子，冲洗加样孔，随后在电泳槽外槽加入适量的1×电泳缓冲液。上样，恒电压150 V电泳。

电泳条件（一板胶）

恒电压	起始电流	终止电流	电泳时间	可选
150V	30-40mA	8-15mA	50 min+	冰浴电泳

四 MMP检测：

4.1 漂洗：

取出凝胶，放入容器内，加入50 ml蒸馏水漂洗凝胶，摇床慢摇5分钟，重复一次。

4.2 复性：

4.2.1  1×复性缓冲液配制：

将10×复性缓冲液用蒸馏水稀释10倍，如10 ml 10×复性缓冲液加90 ml蒸馏水。

注：如10×复性缓冲液由于低温贮存有析出时，37℃彻底溶化后再使用。

4.2.2 复性：

取出凝胶，弃蒸馏水，加入50 ml 1×复性缓冲液，摇床慢摇30分钟。

注：复性结束后，凝胶呈乳白半透明状。

4.3 孵育：

4.3.1 1×孵育缓冲液配制：

将10×孵育缓冲液用蒸馏水稀释10倍，如10 ml 10×孵育缓冲液加90 ml蒸馏水。

4.3.2 孵育：

倒掉1×复性缓冲液，加入50 ml 1×孵育缓冲，37℃ 摇床慢摇10分钟；

     弃1×孵育缓冲液，加入 50 ml 1×孵育缓冲，37℃ 摇床慢摇4小时-过夜孵育。

注：阳性对照-胶原酶IV通常37℃孵育3-4小时即可消化凝胶中的明胶。如样品中MMP 活性低，应延长孵育时间至过夜。

 

4.4 显色：

4.4.1 漂洗：倒掉孵育液，凝胶中加入50 ml蒸馏水，摇床慢摇5分钟，重复一次。

4.4.2 弃蒸馏水，加入50 ml FastBlue染色液（以刚刚覆盖过胶面为适），摇床上常温摇动30分钟-2小时，凝胶大部分区域被深染，在有MMP 条带的位置不被染色而形成透亮区域；蒸馏水漂洗2-3次，每次5-10分钟。

4.5 拍照：

     由于考马斯亮蓝染色，凝胶背景为蓝色，自然光下拍照效果不好。建议使用凝胶观察透射灯（货号：RT3820）底部打光拍照。

 

 

五 实验示例：

 

10%分离胶（含明胶底物）

电泳条件：1×TGS 150V 36-12mA 90 min

实验步骤：

    漂洗：蒸馏水漂洗两次；

复性：50 ml 1×复性缓冲液常温复性30分钟；

              孵育：50 ml 1×孵育缓冲液37度孵育10分钟；

              50 ml 1×孵育缓冲液37度孵育15小时；

漂洗：蒸馏水漂洗两次；

              染色：FastBlue染色60分钟。