Western及IP细胞裂解液

● 产品包装：

产品编号	产品名称	产品包装	说明书
WL0120	Western及IP细胞裂解液	100 ml	1份

● 产品简介：

Western及IP细胞裂解液(Cell lysis buffer for Western and IP)，是一种在非变性条件下裂解细胞的裂解液。本细胞裂解液裂解的细胞，可以用于PAGE，Western，免疫沉淀(immunol precipitation，IP)和免疫共沉淀(Co-IP)。裂解液的主要成分为20 mM Tris (pH7.5)，150 mM NaCl，1% Triton X-100等，裂解后能维持原有的蛋白间相互作用。由于含有较高浓度的Triton X-100等干扰物质，不能用传统Bradford法测定由本裂解液裂解得到样品的蛋白浓度，可以使用BCA蛋白浓度测定试剂盒（货号：RTP7102）或Bradford蛋白浓度测定试剂盒（去垢剂兼容型）（货号：RTP7104）测定蛋白浓度。

● 保存条件：

-20℃保存，一年有效。

● 注意事项：

1.为取得最佳的使用效果，尽量避免过多的反复冻融。可以适当分装后使用。

2. 需自备PMSF或其他蛋白酶抑制剂；如进行蛋白磷酸化研究，还需要自备磷酸酶抑制剂。

3. 裂解样品的所有步骤都需在冰上或4℃进行。

● 使用说明：

1.  准备裂解液：

溶解裂解液，混匀；取适当量的裂解液，在使用前数分钟内加入1/100体积的100 mM PMSF，使PMSF的最终浓度为1 mM。如进行蛋白磷酸化研究，需要加入磷酸酶抑制剂。

2. 细胞蛋白提取：

2.1 贴壁细胞：去除培养液，加入适量1×PBS，轻柔漂洗一遍，不要扰动贴壁细胞。按照6孔板每孔加入100-200 μl裂解液的比例加入裂解液，移液器吹打数下，使裂解液和细胞充分接触，冰上裂解细胞5分钟，用细胞刮刀刮下细胞收集于1.5 ml离心管中，冰上继续裂解15分钟，间歇混匀。

培养板规格/培养皿表面积	细胞量	裂解液推荐使用量
100 mm培养皿	1.5×107	0.5-1 ml
60 mm培养皿	5×106	0.25-0.5 ml
35 mm培养皿	2×106	0.2-0.4 ml
6孔板	2.5×106	100-200 μl
24孔板	5×105	100-150 μl
96孔板	1×105	50-100 μl

2.2 悬浮细胞：450 g 4℃ 离心5 min收集细胞；用适量1×PBS重悬细胞，450 g 4℃ 离心5 min收集细胞；重复漂洗细胞一次；按照细胞沉淀体积（PCV）20 μl加入200 μl 裂解液，混匀细胞沉淀，冰浴处理15分钟，间歇混匀。

注：2×106 Jurkat细胞，其细胞沉淀体积（PCV，Packed Cell Volume）大约为20 μl。

2.3 裂解细胞：

用玻璃匀浆器匀浆，直至充分裂解或通过强烈涡旋震荡使样品裂解充分。冰浴处理15分钟。

注：裂解混合物不建议使用超声波破碎仪处理，因为超声波处理比较剧烈，容易破坏蛋白的相互作用导致蛋白变性。

2.4 离心收集上清：

充分裂解后，4℃ 16000 g离心10分钟，取上清，即可进行后续的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。

3. 组织样品蛋白提取：

3.1 手术切除的组织块迅速置于预冷的生理盐水中，漂洗数次，洗净组织血迹，用滤纸吸干组织表面液体，将组织切成细小的碎片。

3.2 按照每20 mg组织加入200 μl裂解液的比例加入裂解液。(如果裂解不充分可以适当添加更多的裂解液，如果需要高浓度的蛋白样品，可以适当减少裂解液的用量。)

3.3 用玻璃匀浆器冰浴匀浆5-10次，收集匀浆后的裂解混合物。裂解物冰浴处理15分钟。

注：裂解混合物不建议使用超声波破碎仪处理，因为超声波处理比较剧烈，容易破坏蛋白的相互作用导致蛋白变性。

3.4 充分裂解后，4℃ 16000 g离心10分钟，取上清，即可进行后续的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。

实验示例：